三氧化二砷对结肠癌细胞抑制作用的实验研究
作者：郁宝铭 崔 巍 陆爱国 李东华 郑民华
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院(上海200025)
关键词：三氧化二砷；细胞凋亡；结肠肿瘤；药物疗法；小鼠，裸
肿瘤990510 砷剂是治疗恶性肿瘤的化疗药物，19世纪Fowler′s液曾被应用于白血病的治疗[1]。中国传统医学也有砒石(主要成分为As2O3)治疗乳腺癌等肿瘤。以前对砷剂的研究主要局限于致癌、致畸、致突变上。近年来由于As2O3在急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗的临床和基础研究上取得很大进展[2，3]。但关于As2O3对实体肿瘤作用的研究报道很少。作者采用结肠癌LOVO细胞株作为对象，来研究As2O3对结肠癌的抑制效应，探讨应用于大肠癌临床治疗的可能性。
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材料与方法
1.“癌灵一号”，成分0.1% As2O3，由哈尔滨医科大学附属第一医院提供，使用时由RPMI 1640培养液配成所需浓度。
2.细胞培养，结肠癌LOVO细胞株购自中科院上海细胞所。常规培养于含10%小牛血清，50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃，5% CO2培养箱中贴壁培养。
3.四甲基谷氮脞蓝实验(MTT) LOVO细胞以1×105/ml浓度接种于96孔板，每孔加入0.1 ml。细胞进入对数生长期后，加入药物至所需作用浓度，于加药后2、4、6天进行MTT测定。自动酶标仪(EL312E美国)于570 nm波长下测定各孔OD值。按下列公式计算生长抑制率。生长抑制率=〔(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)〕×100%
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4.丫啶橙染色观察凋亡细胞 10 mg丫啶橙溶于100 ml pH为6.8的PBS中，过滤，4℃避光保存。药物作用后的LOVO细胞制成活细胞悬液，浓度为107/ml，取95 μl的细胞悬液，加入5 μl的丫啶橙储存液混匀，吸一滴混合液点于洁净玻片上，直接用盖玻片封片，荧光显微镜观察，摄片。
5.三氧化二砷腹腔内注射对结肠癌细胞腹腔内种植的影响。
(1)人结肠癌腹腔种植模型 稳定传代的LOVO细胞裸鼠腹水瘤模型由上海肿瘤研究所提供。
(2)实验动物 BALB/c(nu/nu)无胸腺裸小鼠，6～8周龄，体重18 g～20 g，雄性，由上海肿瘤研究所提供，共18只，在SPF(Specific pathogen-free condition)条件下饲养。
(3)腹腔种植 取LOVO细胞腹水瘤模型裸鼠18只，70%酒精消毒腹部皮肤后，抽吸血性腹水。同法消毒实验用裸鼠腹部皮肤，将癌性腹水悬液由右下腹进针注入，每只裸鼠接种细胞数量约1×106。
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(4)分组和腹腔内给药 裸鼠随机分成3组。A组：对照组；B组；低剂量组；C组：高剂量组：接种24 h后腹腔内给药，A组腹腔注射生理盐水40 ml/kg，B组，C组注射As2O3分别为2 mg/kg和4 mg/kg，均溶于生理盐水40 ml/kg，连续给药10天。
(5)疗效判定 于肿瘤接种后1月断颈处死所有裸鼠，观察各组成瘤率；取肠管，肠系膜及壁层腹膜作病理切片，HE染色，光镜下观察组织学变化。
结果
一、As2O3对LOVO细胞生长的抑制作用
MTT法显示As2O3对LOVO细胞生长具有抑制作用，并呈时间，剂量依赖关系。
, 百拇医药
二、丫啶橙活细胞染色可见对照细胞丫啶橙荧光在细胞内均匀分布，As2O3作用后的细胞质内可见黄绿色致密浓染的团块或颗粒，是为典型的凋亡细胞。
三、As2O3腹腔内注射对结肠癌细胞腹膜种植的抑制作用
1.成瘤率 肿瘤接种后14天，A组即有裸鼠开始出现腹水征象，至实验结束时该组各鼠均有腹水形成，B组有2只裸鼠出现腹水征象，C组无一出现腹水，见附表。
附表 As2O3腹腔化疗抗癌疗效 分 组
样 本 数(n)
成 瘤 率*
A
, 百拇医药
6
6/6
B
6
2/6
C
6
0/6
χ2检验，P<0.05 *发生肿瘤裸鼠数/接种裸鼠数 2.病理 接种瘤细胞裸鼠一旦出现腹水征象后，腹部迅速膨胀，晚期荷瘤鼠出现消瘦，腹壁极度变薄等恶病质，行动迟缓。有腹水生长裸鼠剪开腹壁后即有暗红色血性腹水溢出，肠管及系膜等处可见直径0.2 cm～1.0 cm左右实体肿块。晚期荷瘤鼠腹腔内几乎全为巨大肿块所充满，肿块间有少量胶冻状物质，游离的血性腹水反而减少。高剂量组各鼠经打开腹腔后，肠壁光滑，系膜透明，未见有结节生长。光镜下观察，对照组肠系膜、肠壁浆膜及壁层腹膜上多个移植瘤生长，瘤细胞幼稚，分化差，呈片状分布，不形成腺样结构，呈浸润性生长。高剂量化疗组肠壁，系膜及腹膜均未见肿瘤生长，系膜间皮细胞局灶性增生，毛细血管增生，充血，淋巴细胞灶性浸润。
, 百拇医药
3.治疗过程中的副作用 低剂量组(2 mg/kg)在治疗过程中有1只裸鼠在9天时出现皮下出血点，散布于头、背、尾部，停药后皮下出血点逐渐消退，其余各鼠治疗过程中均无异常表现。
讨论
砷剂是一种细胞毒药物，它通过与蛋白质的巯基结合而使酶失活，从而导致组织代谢紊乱，引起细胞死亡[4]，但不同细胞对砷剂的敏感性不同。如陈国强等[3]发现As2O3对急性早幼粒白血病(APL)不同的细胞株作用有选择性。利用MTT法研究As2O3对LOVO细胞的抑制作用，发现存在时间、剂量依赖关系。就浓度而言，1.25 μmol/L以下对LOVO细胞的增殖抑制效能差，而在2.5 μmol/L与1.25 μmol/L之间有个飞跃，2.5 μmol/L As2O3即可对LOVO细胞产生较强的抑制作用。
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细胞凋亡(apoptosis)，作者通过丫啶橙活细胞荧光染色的形态学观察，发现As2O3诱导的LOVO细胞死亡呈现凋亡特征。因此推测As2O3对LOVO细胞增殖抑制的作用可能是通过凋亡增强来实现。
As2O3作为一种细胞毒药物，近年来由于其在白血病治疗上显示出良好疗效而逐渐引起人们重视，临床上As2O3静脉注射进入血液系统后，直接作用于白血病细胞起到杀伤作用；在实体肿瘤由于存在瘤内传递障碍，全身给药疗效可能会受到限制。作者在体外证实对结肠癌细胞具有杀伤效应后，建立与术后腹腔内复发机制相似的人结肠癌裸鼠腹腔种植模型，利用大容量腹腔化疗可使药物直接与癌细胞接触的特点，研究不同浓度As2O3对腹腔种植瘤形成的影响。结果表明采用大容量As2O3腹腔化疗模式，可以成功地抑制结肠癌细胞在腹腔内的种植，并提示在机体可耐受的前提下，剂量大，效果好。考虑到IPC所具有的药代动力学优势，将As2O3作为腹腔化疗药物，既可利用其细胞毒性达到对肿瘤细胞的杀伤效应，又可避免静脉给药时过高体循环浓度造成对其它脏器的损伤[5]。而且根据双路化疗理论[6]，设想在As2O3行IPC同时静脉给予它的中和剂二巯基丙醇，以使进入血浆的As2O3被大量解毒剂中和，这样减少了砷剂的毒副作用，又不影响其腹腔内的抗肿瘤效果。
, 百拇医药
砷剂的副作用方面，也有骨髓抑制的报道。因此使用中应常规进行血象监测乃属必要。
作者简介：郁宝铭，男，大学本科，博导，教授，主任医师。
参考文献
[1]Jolliffe DM.A history of the use of arsenicals in man. J R Soc Med,1993,86:287
[2]张 鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58
[3]陈国强，朱 军，石学耕，等.氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡及其分子机制的初步研究.中华血液学杂志，1997，18；25
[4]刘志民著.现代实用毒物分析.北京：人民卫生出版社，1984
[5]Speyer JL.The rationale behind intraperitoneal chemotherapy in gastrointestinal malignancies.Semin Oncol,1985,12(3 Suppl 4):23
[6]Howell SB.Intraperitoneal chemotherapy:the use of concurrent systemic neutralizing agents.Semin Oncol,1985,12(3 Suppl 4):17
(收稿日期：1998-06-15), http://www.100md.com
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院(上海200025)
关键词：三氧化二砷；细胞凋亡；结肠肿瘤；药物疗法；小鼠，裸
肿瘤990510 砷剂是治疗恶性肿瘤的化疗药物，19世纪Fowler′s液曾被应用于白血病的治疗[1]。中国传统医学也有砒石(主要成分为As2O3)治疗乳腺癌等肿瘤。以前对砷剂的研究主要局限于致癌、致畸、致突变上。近年来由于As2O3在急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗的临床和基础研究上取得很大进展[2，3]。但关于As2O3对实体肿瘤作用的研究报道很少。作者采用结肠癌LOVO细胞株作为对象，来研究As2O3对结肠癌的抑制效应，探讨应用于大肠癌临床治疗的可能性。
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材料与方法
1.“癌灵一号”，成分0.1% As2O3，由哈尔滨医科大学附属第一医院提供，使用时由RPMI 1640培养液配成所需浓度。
2.细胞培养，结肠癌LOVO细胞株购自中科院上海细胞所。常规培养于含10%小牛血清，50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃，5% CO2培养箱中贴壁培养。
3.四甲基谷氮脞蓝实验(MTT) LOVO细胞以1×105/ml浓度接种于96孔板，每孔加入0.1 ml。细胞进入对数生长期后，加入药物至所需作用浓度，于加药后2、4、6天进行MTT测定。自动酶标仪(EL312E美国)于570 nm波长下测定各孔OD值。按下列公式计算生长抑制率。生长抑制率=〔(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)〕×100%
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4.丫啶橙染色观察凋亡细胞 10 mg丫啶橙溶于100 ml pH为6.8的PBS中，过滤，4℃避光保存。药物作用后的LOVO细胞制成活细胞悬液，浓度为107/ml，取95 μl的细胞悬液，加入5 μl的丫啶橙储存液混匀，吸一滴混合液点于洁净玻片上，直接用盖玻片封片，荧光显微镜观察，摄片。
5.三氧化二砷腹腔内注射对结肠癌细胞腹腔内种植的影响。
(1)人结肠癌腹腔种植模型 稳定传代的LOVO细胞裸鼠腹水瘤模型由上海肿瘤研究所提供。
(2)实验动物 BALB/c(nu/nu)无胸腺裸小鼠，6～8周龄，体重18 g～20 g，雄性，由上海肿瘤研究所提供，共18只，在SPF(Specific pathogen-free condition)条件下饲养。
(3)腹腔种植 取LOVO细胞腹水瘤模型裸鼠18只，70%酒精消毒腹部皮肤后，抽吸血性腹水。同法消毒实验用裸鼠腹部皮肤，将癌性腹水悬液由右下腹进针注入，每只裸鼠接种细胞数量约1×106。
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(4)分组和腹腔内给药 裸鼠随机分成3组。A组：对照组；B组；低剂量组；C组：高剂量组：接种24 h后腹腔内给药，A组腹腔注射生理盐水40 ml/kg，B组，C组注射As2O3分别为2 mg/kg和4 mg/kg，均溶于生理盐水40 ml/kg，连续给药10天。
(5)疗效判定 于肿瘤接种后1月断颈处死所有裸鼠，观察各组成瘤率；取肠管，肠系膜及壁层腹膜作病理切片，HE染色，光镜下观察组织学变化。
结果
一、As2O3对LOVO细胞生长的抑制作用
MTT法显示As2O3对LOVO细胞生长具有抑制作用，并呈时间，剂量依赖关系。
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二、丫啶橙活细胞染色可见对照细胞丫啶橙荧光在细胞内均匀分布，As2O3作用后的细胞质内可见黄绿色致密浓染的团块或颗粒，是为典型的凋亡细胞。
三、As2O3腹腔内注射对结肠癌细胞腹膜种植的抑制作用
1.成瘤率 肿瘤接种后14天，A组即有裸鼠开始出现腹水征象，至实验结束时该组各鼠均有腹水形成，B组有2只裸鼠出现腹水征象，C组无一出现腹水，见附表。
附表 As2O3腹腔化疗抗癌疗效 分 组
样 本 数(n)
成 瘤 率*
A
, 百拇医药
6
6/6
B
6
2/6
C
6
0/6
χ2检验，P<0.05 *发生肿瘤裸鼠数/接种裸鼠数 2.病理 接种瘤细胞裸鼠一旦出现腹水征象后，腹部迅速膨胀，晚期荷瘤鼠出现消瘦，腹壁极度变薄等恶病质，行动迟缓。有腹水生长裸鼠剪开腹壁后即有暗红色血性腹水溢出，肠管及系膜等处可见直径0.2 cm～1.0 cm左右实体肿块。晚期荷瘤鼠腹腔内几乎全为巨大肿块所充满，肿块间有少量胶冻状物质，游离的血性腹水反而减少。高剂量组各鼠经打开腹腔后，肠壁光滑，系膜透明，未见有结节生长。光镜下观察，对照组肠系膜、肠壁浆膜及壁层腹膜上多个移植瘤生长，瘤细胞幼稚，分化差，呈片状分布，不形成腺样结构，呈浸润性生长。高剂量化疗组肠壁，系膜及腹膜均未见肿瘤生长，系膜间皮细胞局灶性增生，毛细血管增生，充血，淋巴细胞灶性浸润。
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3.治疗过程中的副作用 低剂量组(2 mg/kg)在治疗过程中有1只裸鼠在9天时出现皮下出血点，散布于头、背、尾部，停药后皮下出血点逐渐消退，其余各鼠治疗过程中均无异常表现。
讨论
砷剂是一种细胞毒药物，它通过与蛋白质的巯基结合而使酶失活，从而导致组织代谢紊乱，引起细胞死亡[4]，但不同细胞对砷剂的敏感性不同。如陈国强等[3]发现As2O3对急性早幼粒白血病(APL)不同的细胞株作用有选择性。利用MTT法研究As2O3对LOVO细胞的抑制作用，发现存在时间、剂量依赖关系。就浓度而言，1.25 μmol/L以下对LOVO细胞的增殖抑制效能差，而在2.5 μmol/L与1.25 μmol/L之间有个飞跃，2.5 μmol/L As2O3即可对LOVO细胞产生较强的抑制作用。
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细胞凋亡(apoptosis)，作者通过丫啶橙活细胞荧光染色的形态学观察，发现As2O3诱导的LOVO细胞死亡呈现凋亡特征。因此推测As2O3对LOVO细胞增殖抑制的作用可能是通过凋亡增强来实现。
As2O3作为一种细胞毒药物，近年来由于其在白血病治疗上显示出良好疗效而逐渐引起人们重视，临床上As2O3静脉注射进入血液系统后，直接作用于白血病细胞起到杀伤作用；在实体肿瘤由于存在瘤内传递障碍，全身给药疗效可能会受到限制。作者在体外证实对结肠癌细胞具有杀伤效应后，建立与术后腹腔内复发机制相似的人结肠癌裸鼠腹腔种植模型，利用大容量腹腔化疗可使药物直接与癌细胞接触的特点，研究不同浓度As2O3对腹腔种植瘤形成的影响。结果表明采用大容量As2O3腹腔化疗模式，可以成功地抑制结肠癌细胞在腹腔内的种植，并提示在机体可耐受的前提下，剂量大，效果好。考虑到IPC所具有的药代动力学优势，将As2O3作为腹腔化疗药物，既可利用其细胞毒性达到对肿瘤细胞的杀伤效应，又可避免静脉给药时过高体循环浓度造成对其它脏器的损伤[5]。而且根据双路化疗理论[6]，设想在As2O3行IPC同时静脉给予它的中和剂二巯基丙醇，以使进入血浆的As2O3被大量解毒剂中和，这样减少了砷剂的毒副作用，又不影响其腹腔内的抗肿瘤效果。
, 百拇医药
砷剂的副作用方面，也有骨髓抑制的报道。因此使用中应常规进行血象监测乃属必要。
作者简介：郁宝铭，男，大学本科，博导，教授，主任医师。
参考文献
[1]Jolliffe DM.A history of the use of arsenicals in man. J R Soc Med,1993,86:287
[2]张 鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17：58
[3]陈国强，朱 军，石学耕，等.氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡及其分子机制的初步研究.中华血液学杂志，1997，18；25
[4]刘志民著.现代实用毒物分析.北京：人民卫生出版社，1984
[5]Speyer JL.The rationale behind intraperitoneal chemotherapy in gastrointestinal malignancies.Semin Oncol,1985,12(3 Suppl 4):23
[6]Howell SB.Intraperitoneal chemotherapy:the use of concurrent systemic neutralizing agents.Semin Oncol,1985,12(3 Suppl 4):17
(收稿日期：1998-06-15), http://www.100md.com